Phương pháp PCR- RFLP

Phương pháp PCR- RFLP

PHƯƠNG PHÁP PCR- RFLP

 

Phương pháp PCR- RFLP là gì?

PCR là một kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của sinh vật thành nhiều bản sao ở bên ngoài tế bào.

RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE)

Phương pháp PCR-RFLP được phát minh dựa trên kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction,) được ứng dụng để xác định đa hình gen của các gen ứng viên.

Kỹ thuật PCR-RFLP được tiến hành theo các bước sau:

Phương pháp PCR- RFLP

Phương pháp PCR- RFLP

Li trích DNA từ mô sống

          Tùy vào từng loại mô sống khác nhau mà tiến hành li trích DNA bằng các phương pháp khác nhau. Tuy nhiên chúng điều tiến hành theo nguyên tắc chung.

Quy trình tách chiết DNA

Quy trình tách chiết DNA

Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ

Quang phổ UV được như 1 kỹ thuật định lượng để đo nồng độ của DNA protein. DNA hấp thụ mạnh ở bước sóng 260 nm và kém ở 280 nm trong khi protein thì ngược lại.

DNA được đánh giá là sạch khi có tỷ số 260/280 nằm trong khoảng  1,7-2,0. Việc nhiễm protein sẽ làm tỷ số 260/280 thấp hơn 1,7 ngoài ra sự hiện diện của các chất hữu cơ như phenol, chloroform có thể ảnh hưởng đến nồng độ và độ tinh sạch của DNA.

          Nồng độ DNA ( ng/µl ): 50 x HSPL x OD260

Trong đó:

             HSPL: hệ số pha loãng
             OD260: chỉ số được đo ở bước sóng 260nm

Khuếch đại DNA cần nghiên cứu bằng phương pháp PCR

PCR là phương pháp dựa trên khả năng tái bản phân tử DNA ở ngoài cơ thể. Về nguyên tắc, để tái bản, phân tử DNA cần có một số yếu tố sau: enzyme DNA polymerase; dNTPs; MgCl2;  primer; DNA mẫu.

Sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme giới hạn.

Nguyên tắc: dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.

Khi ủ sản phẩm PCR với enzyme cắt giới hạn trong dung dịch đệm, pH, nhiệt độ thích hợp sẽ tạo ra đoạn DNA với kích thước khác nhau. 

Điện di trên gel agarose và đọc kết quả

Phương pháp điện di nhằm kiểm tra chất lượng DNA, sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme. Tùy vào sản phẩm cần kiểm tra mà sử dụng nồng độ gel agarose, thời gian và hiệu điện thế trong quá trình điện di cho phù hợp. Khi một điện trường được ứng dụng chạy xuyên qua gel, DNA mang điện tích âm ở pH trung tính sẽ chạy về hướng anode, tốc độ di chuyển của các đoạn DNA tỉ lệ thuận với điện thế. Dung dịch đệm điện di ảnh hưởng đến tính di chuyển của DNA trong gel, trong phòng thí nghiệm các dung dịch đệm điện di thường được sử dụng là TAE, TBE, TPE.

————————————

Mọi chi tiết xin liên hệ:

Công ty Cổ Phần Công Nghệ Hiển Long
B40 KDC Kim Sơn, Nguyễn Hữu Thọ, Q.7, HCM
Phòng kinh doanh. Ms.Tuyết. 0978.260.025
Mail: chauthidiemtuyet@gmail.com

Share this post

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *


Vui lòng gọi Ms. Tuyết 0978.260.025 nếu bạn cần hổ trợ thêm thông tin Bỏ qua