PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG DNA

Phương pháp ly trích và kiểm tra chất lượng DNA

1. Phương pháp ly trích DNA

Chuẩn bị mẫu:

Dùng dao y tế bâm nhuyễn khoảng 50–100 mg mẫu cho vào tube 2ml chứa sẳn các hóa chất bao gồm 700ml buffer lysis và 18ml proteinase K, ủ hỗn hợp ở 37^oC trong 12–24 giờ.

Tiến hành li trích

• Thêm 300ml phenol:chloroform: isoamy alcolhol (25:24:1) vào tube chứa mẫu sau đó lắc đều và ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25^oC
• Hút dịch lỏng phía trên cho qua tube mới. Sau đó thêm vào tube 700ml chloroform:chloroform (1:1), lắc đều, li tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25^oC.
• Hút dịch lỏng phía trên cho qua tube mới. Sau đó thêm vào tube 700ml chloroform, lắc đều, li tâm 10.000 vòng 5 phút ở 25^oC.
• Tiếp tục hút phần dịch lỏng phía trên cho qua tube mới. Cho thêm 300ml NaCl 1.2M, 150ml NaOAC2M, 1000ml ethanol 100%,lắc đều, ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25^oC.
• Bỏ phần dịch lỏng bên trên, thu lấy kết tủa, cho thêm 1000ml ethanol 70%  rồi lắc nhẹ, ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25^oC.
• Bỏ phần dịch lỏng, thu lấy kết tủa, để khô DNA ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 200ml TE 1 lần và được trữ ở -20^oC.

2. Kiểm tra chất lượng DNA

Có thể kiểm tra chất lượng DNA (định lượng DNA ) bằng phương pháp quang phổ hoặc bằng phương pháp điện di

2.1 Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ (UV)

Máy đo quang phổ

Quang phổ UV có thể sử dụng như 1 kỹ thuật định lượng để đo nồng độ của DNA và mức độ nhiễm của protein. DNA hấp thụ mạnh ở bước sóng 260 nm và kém ở 280 nm trong khi protein thì ngược lại.

DNA được đánh giá là sạch khi có tỷ số 260/280 nằm trong khoảng  1,7-2,0. Việc nhiễm protein sẽ làm tỷ số 260/280 thấp hơn 1,7 ngoài ra sự hiện diện của các chất hữu cơ như phenol, chloroform có thể ảnh hưởng đến nồng độ và độ tinh sạch của DNA.

Nồng độ DNA ( ng/µl ): 50 x HSPL x OD₂₆₀ 

Trong đó:

HSPL: hệ số pha loãng
OD₂₆₀: chỉ số được đo ở bước sóng 260nm

2.2 Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp điện di

Phương pháp ly trích và kiểm tra chất lượng DNA (1)

• Phương pháp điện di có thể kiểm tra chất lượng DNA, sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme.
• Tùy vào sản phẩm cần kiểm tra để sử dụng nồng độ gel agarose. Thời gian và hiệu điện thế trong quá trình điện di cho phù hợp.

Nguyên tắc: 

• Khi có điện trường chạy xuyên qua gel, DNA mang điện tích âm ở pH trung tính sẽ chạy về hướng anode.
• Tốc độ di chuyển của các đoạn DNA tỉ lệ thuận với điện thế.

Dung dịch đệm: 

• Dung dịch đệm điện di ảnh hưởng đến tính di chuyển của DNA trong gel.
• Trong phòng thí nghiệm các dung dịch đệm điện di thường được sử dụng là TAE, TBE, TPE.